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    解析細(xì)胞凍存液和培養(yǎng)基的配制

    更新時(shí)間:2014-07-29 點(diǎn)擊次數(shù):4202
    解析細(xì)胞凍存液和培養(yǎng)基的配制
    1、準(zhǔn)備工作
    (1)細(xì)胞培養(yǎng)基: 1L; :L-15:500ml; 配置量: 配方 DMEM:350ml; Ham’s F12:150ml;NaHCO3:1.5gHEPES:3.57ginsulin:10mgEGF:50μg滅活 FBS:50ml;雙抗:10ml
    (2)冷凍保護(hù)液:配制量:40ml;配方:FBS:8ml;DMSO:3ml;培養(yǎng)基:29ml
    2、細(xì)胞培養(yǎng)基配制方法 FBS*天準(zhǔn)備工作: 兩支, 提前一晚四度冰箱解凍; 烘干硅膠(用于第二天干燥盒干燥 insulin)
    (1)細(xì)胞培養(yǎng)基配制準(zhǔn)備工作:1L 廣口瓶三個(gè),提前高溫高壓滅菌(用于盛放培養(yǎng)基) ;1L 燒杯一個(gè),三個(gè),;50ml 離心管 22 支 ;
    (2)取一包 Ham’s F12 干粉加入到 800LddH2O 中將溶液反復(fù)沖洗包裝內(nèi)面兩次,倒入培養(yǎng)液中,使干粉充分溶解; 將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到 1L 兩桶中, 取少量 ddH2O 潤(rùn)洗燒杯, 定容至 1000ml。同樣方法配制 L15 培養(yǎng)基和 DMEM 培養(yǎng)基。
    (3)取 L-15:500ml;DMEM:350ml;Ham’s F12:150ml 加入到大燒杯中,配制成混合培養(yǎng)基。
    (4) 取 NaHCO3: 稱(chēng) 1.5gHEPES:3.57ginsulin:10mg全部溶于混合培養(yǎng)基, Insulin 放置于-20℃ 。冰箱中,置于室溫的時(shí)候冰晶解凍為水滴,影響胰島素稱(chēng)量精度,故需要放置到干燥盒中干燥 30min-60min; 稱(chēng)量裝置為精細(xì)天平, 打開(kāi)精細(xì)天平后, 打開(kāi)倉(cāng)門(mén), 放置一張干凈稱(chēng)量紙,按 TARE 鍵清零。用擦凈的藥匙取極少量干粉,觀察示數(shù),加至 0.0100g。小心取出稱(chēng)量紙,將干粉加入到培養(yǎng)基中, 用食指輕輕彈稱(chēng)量紙使剩余粉末進(jìn)入培養(yǎng)基, zui后用少量培養(yǎng)基溶液沖洗稱(chēng)量紙,保證所有 insulin 進(jìn)入培養(yǎng)基。
    (5)利用 NaOH 溶液調(diào) PH 值至 7.5:用之前調(diào)好 PH 測(cè)量器,分別在 7.0、10.0、4.0 處調(diào)試PH,確定后測(cè)定 PH。
    (6)加入雙抗溶液 10ml。
    (7)在超凈臺(tái)上利用 0.2μm 濾膜過(guò)濾除菌(這步驟工作量較大,需要兩個(gè)同學(xué)完成) 。大概過(guò)濾 200ml 后濾膜會(huì)堵住,需要重新更換。
    (8)FBS 滅活:提前約 15min 將水浴鍋打開(kāi),溫度設(shè)置在 54℃(本實(shí)驗(yàn)室水浴鍋溫度通常高于實(shí)際溫度 2℃,實(shí)際溫度以溫度計(jì)為準(zhǔn)) 。用樣品袋包裝盛放 FBS 的 50ml 離心管,擠出空氣,放置在 56 攝氏度下滅活 30min。
    (9)FBS 分裝:分裝到兩個(gè) 15ml 離心管和 20 個(gè) EP 管中,放置于-20℃冰箱中
    (10)分裝:分裝到 50ml 離心管中,4℃保存。細(xì)胞培養(yǎng)基使用前加入 2.5mlFBS,250μlEGF溶液(EGF 溶液濃度為 10ng/μl)。
    3、細(xì)胞凍存液配制:將 FBS:8ml;DMSO:3ml;培養(yǎng)基:29ml 加入到 50ml 離心管中,混勻。
    使用細(xì)胞凍存液凍存細(xì)胞操作方法
    (1)凍存前一天,更換培養(yǎng)基。
    (2)吸出培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基,用 0.05胰酶-EDTA 消化細(xì)胞(根據(jù)培養(yǎng)面積加入相應(yīng)胰酶試劑),5min,吹散細(xì)胞。
    (3)加入與胰酶-EDTA 等量的培養(yǎng)基,終止消化;然后 1000rpm,離心 5min。
    (4)去除上清,加入適量培養(yǎng)基(在 EP 管架上滑動(dòng),使細(xì)胞分散,之后用槍頭輕柔吹打,使細(xì)胞*均勻懸浮) ;進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù):細(xì)胞計(jì)數(shù),取細(xì)胞計(jì)數(shù)器,每孔加 10μl 細(xì)胞懸液,在計(jì)數(shù)區(qū)(中央 25 個(gè)格子) ,用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù),移動(dòng)計(jì)算下方計(jì)數(shù)區(qū)細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞總量計(jì)算公式,AB/2稀釋倍數(shù)106。AB 為上下兩個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)細(xì)胞總數(shù)。
    (5)1000rpm 離心 5min。
    (6)加入適量?jī)龃嬉海ㄔ?EP 管架上滑動(dòng),使細(xì)胞分散,之后用槍頭輕柔吹打,使細(xì)胞*均勻懸浮),使細(xì)胞zui終濃度達(dá)到 1-3106cell/ml。
    (7)將細(xì)胞懸液加入到凍存管中,每管 1ml:凍存管提前用標(biāo)簽筆寫(xiě)入如下信息,細(xì)胞名稱(chēng),傳代次數(shù),細(xì)胞數(shù)量,凍存日期。
    (8)取出凍存盆,在通風(fēng)櫥中向槽內(nèi)加入適量異丙醇(因?yàn)楫惐季哂形⒍拘裕龃婀懿迦氲絻龃媾璧陌疾壑校庞?80℃冰箱中過(guò)夜。
    (9)第二天早上將凍存管轉(zhuǎn)至液氮中:用棉紗布包裹凍存管,用粗棉繩扎緊,打上標(biāo)簽,寫(xiě)上凍存日期,細(xì)胞種類(lèi),傳代次數(shù),細(xì)胞數(shù)量。

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