ProteanFect：小鼠原代T細胞從提取到轉(zhuǎn)染全流程攻略

實驗前準備

1. 材料與試劑：新鮮小鼠脾臟、PBS緩沖液、無菌手術(shù)器械（剪刀、鑷子等）、細胞過濾器、CD4/CD8磁珠分選試劑（如需純化特定亞型），或陰選的方式去除B細胞、單核細胞、NK細胞的磁珠分選試劑，RPMI-1640培養(yǎng)基，人白介素2，胎牛血清，抗生素（如青霉素-鏈霉素）。
2. 設(shè)備：無菌操作臺、離心機、磁力分選架。

從小鼠脾臟獲取單細胞懸液

1. 小鼠頸椎脫臼處死，75%乙醇浸泡5分鐘，取出小鼠置于無菌操作臺上，左腹側(cè)朝上。
2. 在小鼠左腹側(cè)中部剪開小口，撕開皮膚暴露腹壁，可見紅色長條狀脾臟。
3. 在脾臟下側(cè)提起腹膜，剪開后上翻，暴露脾臟，用鑷子提起脾臟，眼科剪分離下面的結(jié)締組織，取出脾臟，剝?nèi)ブ車慕Y(jié)締組織，期間用含有2%FBS的PBS溶液保持脾臟濕潤。
4. 將脾臟放于70UM過濾網(wǎng)中，用注射器針芯輕輕研壓脾臟，用含2%FBS的PBS沖洗過濾網(wǎng)，獲細胞懸液。
5. 300G離心5分鐘，收集細胞沉淀，然后加入紅細胞裂解液裂解，將紅細胞充分裂解，收集白細胞。

從單細胞懸液中分離小鼠原代T細胞

1. 全T細胞分離：利用陰選的方式去除B細胞、單核細胞、NK細胞等，按照分選試劑盒的說明書進行。
2. 亞群分離（如需要CD4+或CD8+ T細胞）：
• 使用CD4或CD8磁珠（如MACS磁珠）分選獲得特定T細胞亞群。
• 將磁珠標記的細胞懸液置于磁性分選裝置中，分離出目標T細胞亞群。

培養(yǎng)與檢測

1. 將分離的T細胞重懸于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，并加入抗生素與人白介素2。
2. 細胞密度一般控制在1-2×10^6 CELLS/ML，放入37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

轉(zhuǎn)染

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