無血清培養(yǎng)基那些你要知道的事

無血清培養(yǎng)基和試劑被廣泛的應(yīng)用于培養(yǎng)哺乳動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物細(xì)胞以制備單克隆抗體，病毒抗原和重組蛋白等。大多數(shù)的無血清培養(yǎng)基含有向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)離子的鐵轉(zhuǎn)蛋白和調(diào)節(jié)葡萄糖攝取量的胰島素，以及一些蛋白質(zhì)和清蛋白，纖維蛋白，胎球蛋白等，這些蛋白在細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)揮各種不同的功能，如提供細(xì)胞貼壁所需的基質(zhì)，抗生物反應(yīng)器剪切力，作為脂質(zhì)和其他生長分化因子的載體等。

那么什么是無血清培養(yǎng)基呢？無血清培養(yǎng)基是不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在體外較長時(shí)間生長繁殖的合成培養(yǎng)基。無血清培養(yǎng)基的基本配方:基本成分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基及添加組分兩大部分。 用于生物制藥和疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，多數(shù)呈貼壁生長或兼性貼壁生長;而當(dāng)其在無血清、無蛋白培養(yǎng)基中生長時(shí)，由于缺乏血清中的各種粘附貼壁因子如纖粘連蛋白、層粘連蛋白、膠原、玻表粘連蛋白，細(xì)胞往往以懸浮形式生長。

了解到什么是無血清培養(yǎng)基之后，那么我們接著了解一下其主要添加成分：

1.促貼壁物質(zhì):許多細(xì)胞必須貼壁才能生長，這種情況下無血清培養(yǎng)基中一定要添加促貼壁和擴(kuò)展因子，一般為細(xì)胞外基質(zhì)，如纖連蛋白、層粘連蛋白等。它們還是重要的分裂素以及維持正常細(xì)胞功能的分化因子，對(duì)許多細(xì)胞的繁殖和分化，起著重要作用。纖連蛋白主要促進(jìn)來自中胚層細(xì)胞的貼壁與分化，這些細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、肉瘤細(xì)胞、粒細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞、CHO細(xì)胞、成肌細(xì)胞等 。

2.促生長因子及激素:針對(duì)不同細(xì)胞添加不同的生長因子。激素也是刺激細(xì)胞生長、維持細(xì)胞功能的重要物質(zhì)，有些激素是許多細(xì)胞必需的，如胰島素。

3.酶抑制劑:培養(yǎng)貼壁生長的細(xì)胞，需要用胰酶消化傳代，在無血清培養(yǎng)基中要須含酶抑制劑，以終止酶的消化作用，達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的。常用的是大豆胰酶;抑制劑。

4.結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白:常見如鐵轉(zhuǎn)蛋白和牛血清蛋白。牛血清蛋白的添加比較大，可增加培養(yǎng)基的粘度，保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷。許多旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基都含有牛血清白蛋白。

5.微量元素:硒是最常見的。

此外，無血清培養(yǎng)基應(yīng)該怎么使用呢？

血清仍是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中最基本的的添加物，尤其是在原代培養(yǎng)或者細(xì)胞生長狀況不良時(shí)，常常會(huì)先使用有血清的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長旺盛以后，再換成無血清培養(yǎng)液。細(xì)胞轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)要有一個(gè)適應(yīng)過程，一般要逐步降低血清濃度，從10%減少到5%，3%，1%，直至無血清培養(yǎng)。在降低過程中要注意觀察細(xì)胞形態(tài)是否發(fā)生變化，是否有部分細(xì)胞死亡，存活細(xì)胞是否還保持原有的功能和生物學(xué)特性等。在實(shí)驗(yàn)后這些細(xì)胞一般不再繼續(xù)保留，很少有細(xì)胞能夠長期培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基而不發(fā)生改變的。細(xì)胞轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)之前，要留有種子細(xì)胞，種子細(xì)胞按常規(guī)培養(yǎng)于含血清的培養(yǎng)基中，以保證細(xì)胞的特性不發(fā)生變化。

為了使細(xì)胞適應(yīng)無血清培養(yǎng)，關(guān)鍵的是使所培養(yǎng)細(xì)胞:

1.處于對(duì)數(shù)生長中期

2.>90% 活細(xì)胞率

3.適應(yīng)時(shí)以較高的起始細(xì)胞接種

細(xì)胞適應(yīng)無血清培養(yǎng)基的方法

1.直接適應(yīng)--細(xì)胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無血清培養(yǎng)基(SFM)中。

一些類型細(xì)胞可直接從包含血清的培養(yǎng)基適應(yīng)無血清培養(yǎng)基。對(duì)于直接適應(yīng)，接種細(xì)胞密度應(yīng)該:2.5×10~3.5×10細(xì)胞/ml。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×10~3×10細(xì)胞/ml時(shí)，傳代培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞密度在培養(yǎng)4到7天后達(dá)到2×10~4×10細(xì)胞/ml時(shí)，細(xì)胞*適應(yīng)了無血清培養(yǎng)基。每隔3~5天，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×10~3×10細(xì)胞/ml，細(xì)胞活率在90%時(shí)，貯備的適應(yīng)了無血清培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)該再次傳代培養(yǎng)。

2.連續(xù)適應(yīng)--分好幾步把細(xì)胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無血清培養(yǎng)基(SFM)中，與直接適應(yīng)相比較，連續(xù)適應(yīng)趨向?qū)τ诩?xì)胞更加溫和一些。

(1)以2倍正常接種密度接種生長活躍的細(xì)胞培養(yǎng)物到75%有血清培養(yǎng)基:25%SFM 混合培養(yǎng)基中，傳代培養(yǎng)。

(2)當(dāng)細(xì)胞密度>5×10細(xì)胞/ml時(shí)，以2×10到3×10細(xì)胞/ml細(xì)胞密度，在有血清培養(yǎng)基:SFM為50∶50的混合培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。

(3)以2×10到3×10細(xì)胞/ml細(xì)胞密度，25%有血清培養(yǎng)基和75% SFM中傳代培養(yǎng)。

(4)當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×10到3×10細(xì)胞/ml(接種后4到6天)，在100%SFM培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。

(5)每隔3到5天，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×10到3×10細(xì)胞/ml，細(xì)胞活率在90%時(shí)，貯備的適應(yīng)了無血清培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)該再次傳代培養(yǎng)。

建議備份前一次混合培養(yǎng)的培養(yǎng)物，直到每一次細(xì)胞適應(yīng)了新的混合培養(yǎng)基。每一次減少血清前，可能需要在SFM/有血清混合培養(yǎng)基中進(jìn)行幾次傳代。

在適應(yīng)過程中，最好不要讓細(xì)胞生長過度。這將增加選擇亞群的可能性。需要注意，與有血清培養(yǎng)基相比，大部分SFM包含非常少的蛋白質(zhì)，因而更易于受外界因素的影響。

細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)替代血清:許多細(xì)胞利用連續(xù)適應(yīng)方法能很好的適應(yīng)，用包含F(xiàn)BS的的培養(yǎng)基和包含有替代血清的培養(yǎng)基1∶1(v∶v)的混合培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。通過下列的混合培養(yǎng)基的方式，連續(xù)幾代減少當(dāng)前培養(yǎng)基的量:1∶2，1∶4，1∶16和100%替代培養(yǎng)基。每次適應(yīng)改變血清比例時(shí)，傳代細(xì)胞2到3次。

培養(yǎng)可以直接從FBS轉(zhuǎn)換到替代血清。一開始就使用相同于FBS的濃度的替代物或血清，生長的延遲可能會(huì)發(fā)生，允許進(jìn)行2到3次的傳代，使生長率恢復(fù)到以前的水平。

特別需要強(qiáng)調(diào)的是:配制無血清培養(yǎng)液必須使用高質(zhì)量的水，如石英玻璃蒸餾器經(jīng)三次蒸餾或超純水凈化裝置制備的水。因?yàn)闊o血清培養(yǎng)基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保護(hù)細(xì)胞的大分子，既便水中的有毒物質(zhì)含量甚微，也可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生致死性損害。這是無血清培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵因素之一。