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    如何用淋巴細胞分離液分離單個核細胞?

    更新時間:2021-05-19 點擊次數:1454
       淋巴細胞分離液可用于體外分離外周淋巴血細胞,也可以從其他來源中分離單核細胞,包括臍帶血細胞和骨髓細胞,適用于從血液及組織勻漿中分離所需細胞,在醫療和醫學生物中廣泛應用。其他人及動物多種比重細胞分離液。
      如何用淋巴細胞分離液分離單個核細胞?
      1)分離外周血中的單個核細胞
      1.抽取正常人靜脈血加到肝素抗凝管中,加等量含5~10IU/ml肝素的無血清緩沖液懸浮細胞。將細胞懸液小心加在與血液等量的淋巴細胞分離液上,室溫中,水平離心500×g 20分鐘。此時離心管中形成5層:最上面是血漿,血漿層和淋巴細胞分離液之間是PBMC,淋巴細胞分離液層和最下面的紅細胞層之間是粒細胞層,又成為棕黃層。
      2.吸去最上層的血漿,收集血漿層和淋巴細胞分離液交界面的單個核細胞,盡量全部吸出PBMC。加1~2倍量含5IU/ml肝素、2%滅活小牛血清的Hanks液(洗滌液),混勻后離心200×g 10分鐘,低速離心有利于去除細胞懸液中留存的血小板,去上清液。
      3.再用同樣洗滌液洗滌細胞2次,每次離心500×g 10分鐘,洗去殘留的淋巴細胞分離液。用1%臺盼藍染色檢測細胞活力(應>95%)并計數細胞。再用含10%小牛血清的細胞培養液將細胞配成適當濃度。通常,每毫升外周血可得1×106~2×106PBMC。
      2)分離關節滑液中的單個核細胞
      1.將關節滑液置含肝素(終濃度5IU/ml)的離心管中,離心1000×g 15分鐘。
      2.用含2%滅活小牛血清的Hanks液懸浮沉淀細胞并洗滌細胞1次,每次離心1000×g 15分鐘。用含2%滅活小牛血清的Hanks液懸浮細胞至原容量。
      3.用淋巴細胞分離液分離關節滑液中的單個核細胞,并用含10%小牛血清的細胞培養液將細胞配成適當濃度。
      3)分離組織中的單個核細胞
      1.取外科分離的各種組織,用含1%慶大霉素和1%小牛血清的MEM培養液洗滌組織塊,洗去可能的污染物。將組織塊置培養皿中,加入約為組織塊體積5~10倍的同樣MEM培養液。用無菌外科剪刀將組織塊剪碎成0.5mm3大小。
      2.將組織塊轉移到小培養瓶中,靜置片刻,吸去培養液。加入約2倍組織塊體積的、濾過除菌的酶溶液。37℃水浴搖床中消化1~2小時,注意組織塊的消化程度。
      3.當組織塊消化分散后,用手用力搖晃培養瓶3~5分鐘或用大口吸管反復吹打,使細胞團進一步分散。加入30ml上述MEM培養液,終止酶反應。
      4.讓上述懸液通過200目的金屬網或尼龍網,分離單個細胞。用上述MEM培養液洗滌細胞3次,每次離心1000×g 10分鐘。用1%臺盼藍染色法檢測細胞活力并計數細胞。
      5.如果細胞量較多(>107),應當用上述淋巴細胞分離液分離出單個核細胞,并用含10%小牛血清的細胞培養液將細胞配成適當濃度。
      4)從小鼠胸腺中分離胸腺細胞
      1.脫臼或剪頭處死小鼠,置75%乙醇中浸泡消毒。腹面向上固定,剪開小鼠胸腔,暴露和摘取胸腺。在平皿中用Hanks液洗凈血液,去除結締組織。
      2.在有少量細胞培養液的平皿中,用鑷子梳理胸腺,再用大口吸管反復吹打,分離單個細胞。離心沉淀細胞,用細胞培養液洗滌細胞1次。加入適量細胞培養液,靜置5分鐘,讓大的組織塊自然沉降,吸出單個胸腺細胞。
      3.用1%臺盼藍染色法檢測細胞活力,計數細胞。再用含10%小牛血清的細胞培養液將細胞配成適當濃度。

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